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环境检测中镉的致畸致癌致突变性实验设计

1 目的与要求
⑴了解实验的基本原理并能进行实验设计。
⑵学习并掌握实验操作步骤及实验结果的计算、分析。据此评定镉的致突变性。
2  原理

3实验条件

②营养琼脂(B.R.)
营养琼脂3.9g,蒸馏水加至100mL,分装于三角瓶,6.80kg20min灭菌备用。
③底层(基本)培养基(即最低营养培养基)
i Vogel-Bonner(V-B)培养基E(50倍的最低营养培养基)硫酸镁(MgSO4·7H2O)1g,单水化合物(C6H8O7·H2O)10g,磷酸氢二钾(K2HPO4·4H2O)17.5g,蒸馏水加至100mL,加热使其全部溶解。可不比校pH,不必灭菌,置4℃冰箱保存备用。
ii葡萄糖贮备液葡萄糖4g、蒸馏水加至100mL,4.08kg10min高压灭菌,待冷却后,4℃冰箱保存备用。
④琼脂培养基
琼脂粉1.5g50×VB、2.0mL,蒸馏水加至93mL,6.80kg20min高压灭菌,待稍凉后,加入葡萄糖贮备液5mL,使充分均匀。待温度降至55℃左右倒入无菌培养皿中,每皿为20mL。琼脂平板可置室温保存。
⑤上层培养基
琼脂粉0.6g,氯化钠0.5g,0.5mML-组氨酸/D-生物素10mL,蒸馏水加至100mL,加热融化混合均匀后趁热分装于试管(1.5cm×10cm),每管2.5mL,15磅灭菌20min,备用。
⑥素琼脂上层培养基
琼脂粉0.6g,氯化钠0.5g,蒸馏水加至100mL,加热融化混合均匀后趁热分装于试管(1.5cm×10cm),每管2.5mL,6.80kg灭菌20min,冰箱保存备用。
⑦0.5mML-组氨酸/D-生物素
L-组氨酸盐酸盐(相对分子量155.16)7.758mg,D-生物素(相对分子量224.1)11.2mg,蒸馏水加至100mL。
⑧细胞生长素(25mML-组氨酸/0.5mMD-生物素)
L-组氨酸盐酸盐(相对分子量155.16)38.79mg,D-生物素(相对分子量224.1)11.2mg,蒸馏水加至100mL。
⑨0.15M氯化钾
6.80kg15min高压灭菌后,置冰箱冷却后备用。
⑩大鼠肝脏微粒体酶提取液(即S-9)的制备
i 酶的诱导 成年雄性大白鼠(体重100-150)3只,按每千克体重腹腔注射诱导物五氯联苯油溶液2.5mL(用玉米油配制,浓度为200mg/mL),诱导酶活力。五天后杀鼠(杀鼠前禁食24h)。
ii 肝匀浆和上清液的制备 将大鼠用重锤击昏,浸泡在消毒水中数分钟,断头放血,暴露胸膛,从肝门静脉处注入冰冷的0.15MKCl溶液洗涤肝脏2-3次。取肝脏称重后,剪碎,每克肝(湿重)加冷冰的0.15MKCl溶液3mL,并用组织捣碎机将肝脏制成匀浆。匀浆液经9000×g离心10min,取上清液分装小管(每管1-2mL),抽样菌检,低温(-20℃)保存备用。
以上操作需要求灭菌条件,并在4℃下进行。
⑶试验菌株
选用鼠寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)组氨酸营养缺陷型菌株TA98、TA100。或选用TA97、TA98、TA100及TA102等一组菌株。试验菌株须经生物学性状鉴定,符合要求后方能使用。

4 实验步骤与方法

 

 实验条件

⑴实验材料
松滋青皮豆。
⑵设备与器材
显微镜,温箱,恒温水浴锅,冰箱,手揿计数器,解剖盘,镊子,解剖针,载玻片,盖玻片,试剂瓶,烧瓶,三角烧瓶,培养皿等。
⑶实验试剂
①5M HCl
②卡诺氏液
无水乙醇(或95%乙醇)3份加冰醋酸1份配成。固定根尖时随时随配。
③席夫氏(Schiff)试剂
称0.5g碱性品红(Fuchsin Basic)加蒸馏水100mL置三角烧瓶中煮沸5min,并不断搅拌使之溶解。冷却到58℃时,过滤于深棕色试剂瓶中,待滤液冷至25℃时再加入10mL1mol/L HCl和1g偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾(NaS2O5或K2S2O5)充分振荡使其溶解。塞进瓶口,用黑纸包好,置于暗处至少24h,检查染色体如透明无色即可使用。此染色液在4℃的冰箱中可储存6个月左右。
④SO2洗涤液

3 试验步骤

⑴ 蚕豆浸种催芽
⑵ 蚕豆根尖染毒
每一处理组选取上述种子6-8粒,放入盛有氯化镉溶液的培养皿中,使氯化镉溶液浸泡住根尖即可,一般染毒4-6h。另设自来水(或蒸馏水)对照组。
⑶根尖细胞恢复培养
将处理后的种子用自来水(或蒸馏水)浸洗3次,每次2-3min。洗净后的种子在放入新铺好湿脱棉的培养皿中,放入25℃的温箱中,使根尖细胞恢复22-24h。
⑷固定根尖细胞
将恢复后的种子,从根尖顶端切下1cm的幼根放入青霉素空瓶中,加卡诺氏固定液固定24h。
⑸孚尔根(Feulgen)染色
①固定好的幼根,在青霉素瓶中用蒸馏水浸洗2次,每次5min。吸净蒸馏水后,再加入5molHCl将幼根浸泡住,连瓶放入28℃水浴锅中水解幼根10min左右,至幼根被软化即可。
②用蒸馏水浸洗幼根2次,每次5min。吸进蒸馏水后,在暗室或遮光的条件下加席夫氏(Schiff)试剂,用量以淹住幼根液面高出2mm为宜。
③除去染液,并用SO2洗涤液浸洗幼根2次,每次5min,然后再用蒸馏水浸洗5min。
④将幼根放入新换的蒸馏水中,置4℃的冰箱内保存,可供随时制片使用。
⑹制片
将幼根放在擦净的载玻片上,用解剖针截下1mm左右的根尖,滴上少许45%的醋酸溶液,用解剖针将根尖捣碎,然后加一清洁的盖玻片,并在盖玻片上加一小块滤纸,轻轻敲打压片。
⑺镜检及微核识别标准
每一处理观察5个根尖,每个根尖观察1000个细胞,并计数其中有微核的细胞数(微核千分率)。
 

哺乳动物骨髓细胞染色体畸变分析

1 实验原理

骨髓细胞染色体畸变分析试验,是一种体内致突变试验方法。它反映受试物在体内经活化和解毒等代谢途径后对体细胞的致突变作用。所有生物细胞的染色体均有一定的数目和特定的形态结构,并且这些特征相对稳定。如果环境中的诱变剂作用于生物体,染色体的数目和形态就可能发生改变,即染色体畸变。在细胞分裂的中期相可表现出来。故可通过观察中期相细胞结构和数目的改变与否,来评定化学物质是否具有致突变作用。
2实验条件
⑴器材
电冰箱,离心机,显微镜,恒温水浴箱,扭力天平,定时钟,电吹风,手术剪刀,普通剪刀,无齿钳,小型手术骨钳,注射器(1mL、2mL),针头,刻度尖底离心管(10mL),玻璃染色缸,载玻片,带橡皮头吸管,试管架,酒精灯,玻璃蜡笔。
⑵试剂
①0.1%秋水仙素
②2.2%柠檬酸钠
③吉姆萨(Giemsa)贮备液
④0.075molKCl溶液,用蒸馏水配制
⑤甲醇-冰醋酸固定液
⑥pH=6.8磷酸缓冲液
⑦二甲苯
⑧阳性对照物
环磷酰胺或丝裂霉素C
⑶受试动物

3 实验步骤与方法

⑴ 剂量:至少应用三种不同剂量组,高剂量以50%细胞生长抑制浓度为基准
⑵ 对照组:常用溶媒作阴性对照,已知染色体断裂剂作阳性对照。
⑶外周血淋巴细胞和培养。 ②培养:将无菌新鲜血0.4m1加人含5m1培养液(为克服体外实验缺乏代谢活化酶的缺点,在细胞培养基中需加人肝脏微粒体酶进行活化,以提高阳性检出率)的无菌培养瓶中,轻轻摇匀。将培养瓶放在37℃水浴或培养箱中培养72小时。
③受试物与培养细胞接触的时间:受试物(药物)与培养细胞接触后应用适当的时间,最好包括整个细胞周期,通常在受试物处理后24小时和48小时终止培养。

⑷ 培养细胞的处理: ⑹染色:一般常用Giemsa染色法。直接在Giemsa应用液中染色20分钟,取出用蒸馏水冲洗干静、晾干。
⑺镜检:先用低倍镜观察,寻找染色体分散度较好的图系,然后在高倍镜下观察染色体的变化。每种浓度至少观察100个中期分裂相细胞的染色体结构的异常以染色体有无断裂、缺失、互换和裂隙等作为畸变指标)及多倍体的出现率。
⑻结果判定:根据出现畸变染色体的总数和染色体畸变的细胞数,计算畸变率。
 

目的

通过该实验,学习和掌握小鼠精子畸形实验的原理和步骤

原理

精子畸形是指精子形状改变和畸形精子数量增多。
生殖系统对化学毒物的敏感性。
用检测雄性动物接触化学毒物后精子畸形率的高低,来反应该化学毒物的生殖毒性和对生殖细胞潜在的致突变性。

实验动物和材料

实验动物:雄性小鼠 (6-8周)24只
实验材料:
(1)器材:眼科剪、眼科镊、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、吸管
(2)试剂:生理盐水、甲醇(分析纯)、 2%伊红水溶液环磷酰胺( 50mg/kg )

动物分组及处理

阳性对照组:8只雄鼠,环磷酰胺腹腔注射三次
空白对照组:16只雄鼠,不做处理


阅片:低倍镜找到背景清晰、精子重叠较少的部位高倍镜 按顺序检查精子的形态。每只动物检查完整的精子1000个。

实验结果分析与评价

精子畸形 主要表现在头部,畸形的类型可分为无钩、香蕉形、无定形、胖头、双头以及双尾等。
精子畸形百分率分别记录各种类型畸形的精子,进行精子畸形类型构成比分析,并计算每组动物精子畸形百分率。
 

显性致死试验

原理与目的

动物显性致死试验是观察哺乳动物生殖细胞染色体损伤的一种方法。生殖细胞在减数分裂期和受精期最易发生突变,突变后失去与异性生殖细胞结合的能力或者结合后会出现发育不正常的胚胎,以致造成总着床数减少或早期胚胎死亡及畸胎等现象。

2     实验动物常用性成熟的雄性小鼠15只,孕鼠20只以上。

操作步骤

 一般设三个剂量组,最高剂量约为 的1/10-1/3,一次或连续,每天染毒一次(灌胃或腹腔注射),同时设阴性和阳性对照组,于最后一次染毒后1-2天开始交配,每只雄鼠与2-3只雌鼠同笼5天。休息两天后另与2-3只未交配过的新雌鼠同笼5天。如此连续6-8周。每只雌鼠于同笼的第3天算起的第13-14只处死,检查子宫的着床数、早期死胎、晚期死胎和活胎数。计算各组的受孕率,着床数、活胎数、早期死胎数(以着床数计)。

结果分析与评价

经适当的统计学分析,如平均活胎数显著减少,平均死胎数显著增加,有一个或多个死胎的母鼠数增加三项标准中有两项达到要求,即可判为阳性。分析各周交配的显性致死情况,可检出精子是处于哪个发育阶段受到遗传毒作用。染毒后头3周交配的结果表示对精子和精细胞的作用。第4-5周交配的结果表示对精细胞的作用,第6周及以后的结果表示对精原细胞和干细胞的作用。
 

二、致畸试验设计

1原理

母体在孕期受到可通过胎盘屏障的某种有害物质作用,影响胚胎的器官分化与发育,导致结构和机能的缺陷,出现胎儿畸形。因此,在受孕动物的胚胎着床后,并已开始进入细胞及器官分化期时投与受试物,可检该物质对胎儿的致畸作用。              

2目的

通过在胚胎器官形成期连续给药,观察镉对大鼠的致畸毒性,确定其未观察到发育毒性的剂量。确定其未观察到发育毒性的剂量

3试剂及配制实验用水为蒸馏水。

3.1  试剂:甲醛、冰乙酸、2,4,6-三硝基酚、氢氧化钾、甘油、水合氯醛3.2  茜素红贮备液:茜素红-S,50%乙酸饱和液5.0 mL,甘油10.0 mL,1%水合氯醛溶液60.0 mL混合,放人棕色瓶中。
3.3  茜素红应用液:取贮备液3~5mL,用1~2g/100 mL氢氧化钾液稀释至1000 mL存于棕色瓶中。
3.4  透明液A:甘油200 mL、氢氧化钾10g,蒸馏水790 mL混合。
3.5  透明液B:甘油与蒸馏水等量混合。
3.6  固定液:Bouins液:2,4,6.三硝基酚75份、甲醛20份、冰乙酸5份。

4 仪器与设备

4.1  实验室常用设备。
4.2  生物显微镜及体视显微镜。
4.3  游标卡尺(百分尺)。

5 试验动物健康性成熟Wistar品系大白鼠90~100d龄、♀200-230g,

♂250~270g ,雄性,雌性均为处女鼠。

6 剂量分组

设五个组,一个阴性对照,一个为阳性对照,3个氯化镉剂量组(25、15、5mg/kg),即1/4、1/16、1/64LD50,每组15只孕鼠。本实验选用环磷酰胺(cp)作为阳性对照。生理盐水为阴性对照组。

7 操作步骤

7.1“受孕动物”的检查和给受试物时间
性成熟雌、雄大鼠按2:1同笼后,每日早晨观察阴栓(或阴道涂片),查出阴栓或精子认为该鼠已交配,当日作为“受孕”零天。如果5d内未交配,应更换雌鼠。捡出的“孕鼠”随机分到各组,并称重和编号,氯化镉和阴性对照组在受孕的第7d~16d,每天经口给予氯化镉和生理盐水(按1.0 mL/100g体重计)。阳性对照组于孕期第11~13d腹腔注射环磷酰胺(cp)7mg/kg。于受孕的0d、7d、12d、16d、20d称体重,并根据体重计算氯化镉的用量。
7.2孕鼠处死和检查
Wistar大鼠于妊娠第20d处死。用2d/100 mL硫喷妥钠1~1.5mL/只腹腔注射,麻醉或直接断头。剖腹取出子宫称重、记录并检查胚胎、着床数、早期吸收胎,迟死胎及活胎数。
7.3  活胎鼠检查
逐个记录胎仔性别、体重、体长和尾长,检查胎鼠外现有无异常,如头部有无脑膨出、露脑、小头、小耳、小眼、睁眼、唇裂、下颌裂,躯干部有无腹壁裂、脐奶、脊柱弯曲,四肢有无小肢、短肢、并趾、多趾、无趾等畸形,尾部有无短属、卷尾、无尾,肛门有无闭锁。
7.4  胎鼠骨标本的制作与检查
将每窝1/2的活胎(奇数或偶数)放入95%乙醇中固定2~3周,取出胎仔(或可去皮、去内脏及脂肪)流水冲洗数分钟后放人1~2g/100 mL的氢氧化钾溶液内(至少5倍于胳仔体积)8~72h透明后放人茜素红应用液中染色6~48 h,并轻摇1~2次/d,至头骨染红为宜。再放人透明液A中1d~2d放人透明液B中2d~3d,待骨骼染红而软组织基本褪色,将标本放入小平皿中,用透射光源,在体视显徽镜下作整体观察,然后逐步检查骨骼。①测量卤门大小、矢状缝的宽度、头顶间骨及后头骨缺损状况,②检查胸骨的数目,缺失或融合(胸骨为6个,骨化不全时首先缺第5胸骨、次为缺第2胸骨)。③肋骨通常12~13对,检查有无融合肋、分叉肋、波状肋、短肋、多助、缺肋、肋骨中断。④脊柱发育和椎体数目(颈椎7个,胸椎12~13个,腰椎5~6个,底椎4个,尾椎3~5个),检查有无缺失、融合、纵裂等畸形⑤最后检查四肢骨有无畸形。
7.5  胎鼠内脏检查
每窝的1/2胎鼠放人Buins液中,固定两周后作内脏检查。先用水冲去固定液,将鼠仰放在石蜡板上,剪去四肢和尾,用刀片从头部到尾部逐段横切或纵切。按不同部位的断面观察器官的大小、形状和相对位置。
a 经口从舌与两口角向枕部横切,可观察大脑、间脑、正脑、舌及颚裂。
b 在眼前面作垂直纵切,可见鼻部。
c 从头部垂直通过眼球中央作纵切。
d 沿头部最大横位处穿过脑作切面。
以上切面的目的是观察舌裂、颚裂、眼球畸形、脑和脑室异常。
e 沿下颚水平通过颈部中部作横切面,可观察气管、食管和延脑或脊髓。
以后自腹中线剪开胸、腹腔,依次检查心、肺、横隔膜、肝、胃、肠等脏器的大小、位置,查毕将其摘除,再检查肾脏、输尿管、膀胱、于宫或睾丸位置及发育情况。
然后将肾脏切开,观察有无肾盂积水与扩大。

统计方法及结果评定

孕鼠增重用方差分析或非参数统计,胎鼠身长、体重、窝平均活胎数用T检验。结果可得出受试物是否有母体毒性和胚胎毒性、致畸性,量小致畸剂量。为比较不同有害物质的致畸强度,可计算致畸指数,致畸指数10以下为不致畸。10~100为致畸,100以上为强致畸。表示有害物质在食品中存在时人体受害几率,可计算致畸危害指数,如指数大于300说明该物对人危害小,100~300为中等,小于100危害大。
致畸指数=(雌鼠LD50)/(最小致畸剂量)
致畸危害指数=(最大不致畸剂量)/(最大可能摄入量)
 

三、致癌试验设计

用于致癌物筛选的短期试验

(一)致突变试验

①基因突变试验:鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验);
②染色体畸变试验:体外细胞系细胞遗传学分析,小鼠骨髓微核试验,大鼠骨髓染色体畸变试验;
③原发性DNA损伤:SCE试验;
④体外细胞转化

(二)哺乳动物短期致癌试验

 哺乳动物短期致癌试验又称为有限体内试验,指时间有限(数月),靶器官有限。
较受重视的短期致癌试验有下列四种:
1.小鼠皮肤肿瘤诱发试验:于小鼠皮肤局部连续涂抹受试物,以观察皮肤乳头瘤和癌的发生,一般20周可结束实验,较敏感的小鼠为SENCAR小鼠。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。
2.小鼠肺瘤诱发试验:染毒途径常用腹腔注射,也可灌胃或吸入,一般30周可结束实验,观察肺肿瘤的发生。较敏感的小鼠为A系小鼠。
3.大鼠肝转化灶诱发试验
对大鼠进行肝大部切除术后,给以受试物,一般可在8~14周结束实验,观察肝转化灶生成。肝转化灶是癌前病变,有γ-谷氨酰转肽酶活性升高,G6P酶和ATP酶活性降低,以及铁摄取能力降低。转化灶可用组织化学或免疫化学方法鉴定。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。
4.雌性大鼠乳腺癌诱发试验,一般可用SD大鼠(或Wistar大鼠),实验周期为6个月。
但针对果实膨大剂现有的应用状况,并没有表现强的致突变、致癌效应,应设计长期致癌试验,如下:

(三)试验动物

物种和品系:要求用两种实验动物,常规选用大鼠和小鼠,在选择品系时应选择较敏感、自发肿瘤率低、生活力强及寿命较长的品系。本实验选用wistar大鼠。
性别:同等数量的雌雄两种性别的动物。
年龄:使用刚断乳的动物,以保证有足够长的染毒和发生癌症的时间,而且幼年动物解毒酶及免疫系统尚未完善,对致癌作用比较敏感。 

(四)剂量选择和动物数量

致癌试验一般设三个试验组。
美国NCI推荐以最大耐受剂量(MTD)为高剂量。最大耐受剂量是由90天毒性试验来确定的,此剂量应使动物体重减轻不超过对照组的10%,并且不引起死亡及导致缩短寿命的中毒症状或病理损伤。
ICH(1995)提出,高剂量选择可以根据:①毒性终点,即最大耐受剂量(MTD);②药代动力学终点,啮齿动物血浆AUC(时量曲线下面积)为人的25倍;③选择吸收饱和剂量;④药效学终点,不应产生生理学和内稳态紊乱;⑤最大可行剂量,受试物在饲料中最高含量为5%。限制剂量为1500mg/(kg体重•d)。
剂量选择:中及低剂量组则按等比级数下推,如分别为上一个剂量水平的1/2或1/3。低剂量组应不影响动物的正常生长、发育和寿命,即不产生任何毒性效应。中剂量组介于高、低剂量之间,对照组除不给受试物外,其他条件均与试验组相同。
同时应设阴性(溶剂或赋形剂)对照组,设阳性对照组,
动物数量:每组至少有雌雄各50只动物,希望在出现第一个肿瘤时,每组还有
不少于25只动物。

(五)染毒途径

吸入染毒,每天染毒4小时,每周5~7天。染毒柜内受试物浓度应定期或连续监测,其分布应均匀、恒定。

六)试验期限

ICH(1997)建议参考下面几条准则:
(1)一般情况下,试验期限小鼠和仓鼠应为18个月,大鼠为24个月;然而对于某些生命期较长或自发肿瘤率低的动物品系,小鼠和仓鼠可持续24个月,大鼠可持续30个月。
(2)当最低剂量组或对照组存活的动物只有25%时,也可以结束试验,对于有明显性别差异的试验,则试验结束的时间对不同的性别应有所不同,在某种情况下因明显的毒性作用,只造成高剂量组动物过早死亡,此时不应结束试验。
 
 1.一般观察    每天观察受试动物一次,主要观察其外表、活动、摄食情况等。在实验最初三个月每周称体重一次,以后每两周称体重一次。经饲料或饮水给以受试物时,应记录食物消耗量或饮水量,以计算受试物的摄入量。观察时要注意有无肿瘤出现、肿瘤出现时间及死亡时间。老年动物多病易死,应加强巡视,防止动物死亡后未及时刻验,发生尸体组织自溶。
2.病理检查  动物自然死亡或处死后必须及时进行病理检查,包括肉眼和组织切片检查。组织切片检查应包括已出现肿瘤或可疑肿瘤的器官和肉眼检查有明显病变的器官,应注意观察癌前病变。通过病理检查确定肿瘤的性质和靶器官。
3.结果分析  统计各种肿瘤的数量(包括良性和恶性肿瘤)及任何少见的肿瘤、患肿瘤的动物数、每只动物的肿瘤数及肿瘤潜伏期。
肿瘤发生率(%)=(实验结束时患肿瘤动物总数/有效动物总数)×100%
4. 结果评价
(1)应着重报告发现肿瘤的部位、数量、性质、癌前病变,以及其他毒性效应;
(2)应报告剂量—反应关系及统计学分析结果。
(3)评价该试验不同剂量良性肿瘤和恶性肿瘤的相对数量可有助于确定该受试动物对受试物的剂量反应关系。另一方面,如果仅观察到良性肿瘤,并无恶性化进展的证据,则将此受试物认为是致癌物是不适宜的,此仅提示在该试验条件下需要调整。
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